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不同前处理方法对饲草中黄曲霉毒素B1测定的影响

文章出处:张经理责任编辑:苏微人气: 发表时间2019/10/11 15:37:47【
  要:本试验以样品加标回收率为指标,比较了液-液萃取、直接提取、亲和层析三种前处理方法对饲草中黄曲霉毒素B1测定值准确性影响。应用酶联免疫法(ELISA)进行测定,并通过液相色谱荧光检测法(HPLC)进行验证。结果,采用液-液萃取-ELISA法,平均回收率在70.0~102.0%,且相对标准偏差(RSD)<6.6%,亲和层析净化后ELISAHPLC结果基本一致,但较液-液萃取测定值低。提示液-液萃取法作为ELISA检测饲草中黄曲霉毒素B1的前处理方法为最佳方法。

关键字:饲草;黄曲霉毒素B1ELISA;测定

黄曲霉毒素B1(简称AFB1)是黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的次级代谢产物,是目前发现毒性最强的真菌毒素,主要污染玉米、花生、大豆及稻草等[1]。奶牛摄入被AFB1污染的饲料后,很少一部分被瘤胃微生物代谢,大部分通过被动扩散进入消化道,在肝脏羟基化形成黄曲霉毒素M1简称AFM1。残留在乳中的AFM1也是一种强致癌物质[2]。目前几乎所有的国家和地区都规定了食品和饲料中AFB1的最大允许量国内规定奶牛精料补充料AFB1的上限为10 μg/kg[3]

控制好秸秆类粗饲料中AFB1的含量可以从源头上杜绝牛奶中AFM1超标的现象。酶联免疫法(ELISA)因灵敏度高、速度快等优点[45]常作为AFB1的首选分析方法,但样品基质中的干扰因子(色素、PH等)常造成结果的假阳性[6,7]。为此本试验采用羊草、苜蓿、饲化秸秆为样品,以加标回收率为指标,比较了液-液萃取、直接提取及亲和层析三种前处理方法的准确性,以确定饲草样品前处理的最佳方法。

1、材料与方法

1.1  样品

     苜蓿、羊草、青贮秸秆与饲化秸秆类3个批次10份样,南京周公草科技发展广东11选5;

1.2  试剂

黄曲霉毒素B1酶免试剂盒,江苏省苏微微生物研究广东11选5生产;甲醇(分析纯);三氯甲烷;样品稀释液:含20%甲醇的PBS溶液;AFB免疫亲和柱 中检维康。

1.3 仪器

     酶标仪MK3 美国热电;振荡器 德国IKA;恒温培养箱 上海跃进医疗;氮吹仪 杭州奥盛仪器;离心机 ;植物粉碎机 ;高效液相荧光色谱仪LC-20A(含RF-10AxL荧光检测器) 日本岛津。

1.4 样品处理方法

1。4。1直接提取:称取粉碎均匀的粗饲料5.0g50mL具塞离心管中,准确加入25mL50%甲醇水溶液,振荡15min4000r/min,离心10min,取上清液,样品稀释液稀释不同倍数后,待测。

1.4.2液液萃取:称取粉碎均匀的粗饲料5.0g100mL具塞三角瓶中,准确加入50mL50%甲醇水溶液,振荡15min,4000r/min,离心10min。准确吸取上清液10mL125mL分液漏斗中,加入20mL三氯甲烷,加塞轻轻振摇3min,静置分层。放出下层,经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的快速定性滤纸过滤于100mL蒸发皿中,最后用少量三滤甲烷洗涤过滤器,一并收集于试管中,氮气吹干,4mL甲醇溶解PBS缓冲液定容于20mL,待测。

1.4.3亲和层析:称取粉碎均匀的粗饲料25g250mL具塞三角瓶中,准确加入100mL80%甲醇水溶液,振荡15min,过滤,取上清液10mL、蒸馏水40mL混匀,10mL混匀液以1-2/秒流速过亲和柱,10mL蒸馏水同流速洗柱,再以1mL色谱纯甲醇同流速洗脱,样品稀释液稀释后待测。

1.5 测定方法

1.5.1酶联免疫测定:参照GB/T 17480-2008测定步骤[8]

1.5.2高效液相测定:参照GB/T 18979-2003测定方法[9]略作改动。取1.4.3甲醇洗脱液250µL,氮气挥干,加入1mL正己烷及0。5mL三氟乙酸,混匀1min,室温下放置10min,氮气吹干,85%乙腈水重新溶解,混匀30s,经0。45µm滤膜,供液相测定。色谱条件:流动相,甲醇:乙腈:=1:3:6,流速0。8mL/min检测波长365nm激发波长425nm,柱温40,进样20µL

1。5。3不同稀释倍数的测定(研究稀释倍数对测定值的影响)

取苜蓿、羊草、青贮秸秆及饲化秸秆分别按照1.3.1方法进行提取,用样品稀释液稀释2468倍后,以1.5.1方法测定。

1。5。4加标回收测定

平行称取粗饲料样品4份,1份空白,另3份分别添加浓度为50ug/LAFB1标准溶液,配制成102040ug/kg的浓度,分别按照1.4所述方法来进行提取,以1。5。1方法测定。

1.5.5 -液萃取重复性

取同一份饲草样品,平行称取共计8份,按照1.4.2方法来进行提取,以1.5.1方法测定,计算RSD值。

1。5。6-液萃取ELISA,免疫亲和-ELISA与免疫亲和-HPLC测定比较

取苜蓿、羊草、青贮秸秆及饲化秸秆按照1.4.2方法进行提取,用样品稀释液稀释2倍后,按1.5.1方法测定。同时取相同样本进行1。4。3方法进行提取,按1.5.11.5.2分别测定。

2、结果与分析

2.1稀释倍数对测定值的影响

从图1结果可以看出,采用直接提取方法,测定羊草、苜蓿或者饲化秸秆时,随着稀释倍数的扩大,测定值从高到低并趋于稳定。推其原因可能是提取液中存在样品基质的干扰,造成开始测定数值的偏高,但是随着稀释倍数的增加,干扰因子的作用逐渐减弱,因而测定值趋于稳定。

1 直接提取-不同稀释倍数对测定值的影响

2.2加标回收测定

2不同样品三种提取方法平均回收率

从图2结果可以发现,秸秆、羊草或苜蓿采用直接提取时,平均回收率均大于105%,甚至达到130%,结果呈一定的假阳性;而采用液-液萃取的方法后,平均回收率在70%~102%之间,回收测定较为稳定;采用亲和层析净化后,平均回收率均小于60%,结果偏阴性。这说明饲化秸秆、羊草或苜蓿直接提取测定存在干扰,与图1的结论相同。由于样品中AFB1的真实浓度无法得知,所以采用提取后直接稀释一定的倍数测定误差较大。研究发现在提取苜蓿样品时,50%甲醇提取AFB1时效果不理想,改用甲醇:乙腈:=3:2:5(体积比)后,平均回收率达85%以上,效果比较满意。

2。3-液萃取重复性

由表1中的数据可以发现液-液萃取重复性较好,RSD均小于10%

1 不同样品液-液萃取重复性测定

样品名称

测定次数

均值

µg/kg

标准偏差

CV%

1

2

3

4

5

6

7

8

羊草

4.3

4.1

3.9

4.8

4.7

4.3

4.6

4.6

4.4

0。29

6.6

苜蓿

4.6

5.2

5.4

5.6

5.3

4.8

5.2

5.1

5.2

0.3

5.8

饲化秸秆

8.1

7.6

8.6

8.8

9.1

7.9

8.3

8.9

8.4

0.49

5.8

2.4-液萃取-ELISA,亲和层析-ELISA与亲和层析-HPLC测定比较

从表2可知,液-液萃取-ELISA的测定值较亲和层析-ELISA测定值要高,而亲和层析-ELISA与亲和层析-HPLC的测定结果基本一致(前者小于1,后者未检出)。在比较了AFB1分别在甲醇水的溶液体系与饲草提取液溶液体系,以亲和层析净化后,检测发现回收率后者仅为前者的70%,提示净化后损失较大,主要原因是亲和层析处理样品溶液时,存在洗脱不完全的问题,测定值偏低。研究同时发现,在亲和层析净化时,当AFB1进样量小于20ng时,由于柱填料非特异性吸附的影响,回收率<50%。表2中,液-液萃取-ELISA测定结果发现,饲化秸秆中AFB1含量为8.1μg/kg,经样品处理稀释及亲和柱回收的影响,液相检测衍生前的浓度约为2.0ng/mL,依然高于液相的灵敏度(1.0ng/mL),但是免疫亲和层析-HPLC均未检出,表明亲和层析化损失较大。

2 不同方法处理后样品AFB1测定结果         单位:µg/kg

注:“-”为未检出

3、结论

1、直接提取结果偏高主要因素有:饲草青贮的过程中为了防止再次霉变,多用化学熏蒸[10],或使用氨化后微生物发酵等方法处理,致使色素、pH、化学残留物等因素对测定的干扰。再因饲草密度轻,吸水性是不可避免的问题,导致提取液的实际浓度偏高,结果呈现一定的假阳性。

2、液-液萃取过程中需要注意的问题是,一般要求反复萃取2~3次,才能获得大于99%的回收率[11],在三氯甲烷挥干时,少量水相即可用甲醇先溶解残渣后再用蒸馏水定容,这样得到的溶液均一。

3、通过回收率的测定比较,液-液萃取方法作为饲草类样品的提取较为合适,结果较为准确,但是还存在处理操作复杂,处理时间长,且消耗有机溶剂体积大的问题。

4、免疫亲和层析因净化彻底而被广泛应用[12],但如何降低非特异性吸附来提高回收率,还需进一步研究。

 

参考文献

[1]陈宁庆。实用生物毒素学[M].中国科学技术出版社.2001:406-447

[2]张东升等。黄曲霉毒素M1的危害、污染现状及检测方法进展[J]。中国卫生检验杂志.2004.14(3):266-269.

[3]GB 13078-2001。饲料卫生标准[S].北京:中国标准出版社.2001

[4]蒋成等.酶免疫测定法[M]。北京人民卫生出版社.1984

[5]李岩松,周玉,谭建华.真菌毒素快速分析方法研究进展[J].中国卫生检验杂志,2006,161):126-129.

[6]赵春城等.有机相萃取法消除ELISA检测AFB1假阳性的研究[J].饲料工业.2003.24(3):40-43

[7]李姣,佘之蕴,林耀文,等。月饼中黄曲霉毒素B1检测前处理方法的改进[J]。现代食品科技,2012,283):364-366.

[8]GB/T17480-2008。饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法[S]。北京:中国标准出版社,2008.

[9]GB/T18979-2003。食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱和荧光光度法[S]。北京:中国标准出版社,2003.

[10]刘亚男等.霉菌毒素对奶牛养殖业的危害[J].奶牛杂志.2007.11:26-27

[11]王立等。色谱分析样品处理[M].化学工业出版社.2001:48

[12]肖付刚,赵晓联,汤坚,等.免疫亲和层析及其在真菌毒素检测中应用[J].粮食与油脂,2007,8:40-43.

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